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lunedì 7 maggio 2018

Abstracts delle tre migliori tesi di laurea sulle malattie rare VIII Edizione (2017/2018)

Premio nazionale delle tre migliori tesi di laurea sulle malattie rare  
VIII Edizione (2017/2018)

Abstracts delle tesi premiate


Primo premio:analisi dei microRNA su motoneuroni derivati da Cellule Staminali Pluripotenti Indotte (iPS) come terapia molecolare della SLA(dott.ssa Martina Locatelli, Università Degli Studi Di Milano)
La Sclerosi Laterale Amiotrofica (SLA) è una malattia neurodegenerativa che colpisce i motoneuroni (MN) superiori e inferiori situati nel cervello e nel midollo spinale. La maggior parte dei casi di SLA si manifesta in modo sporadico, ma in una piccola percentuale di soggetti (circa il 10%) la malattia si trasmette all’ interno di una stessa famiglia, solitamente seguendo una modalità di trasmissione di tipo dominante ad elevata penetranza. Le cause e i meccanismi patogenetici responsabili della progressiva perdita di motoneuroni non sono ancora completamente noti, anche se le ultime ricerche sono concordi nell’indicare alterazioni a carico dell’RNA come possibile elemento chiave nella patogenesi della malattia. In particolare è emerso il ruolo dei micro-RNA (miRNA), piccoli frammenti di RNA non codificante implicati nella regolazione genica. Dato che i miRNA sono fondamentali per mantenere l’omeostasi neuronale, è stato ipotizzato che alterazioni della loro espressione possano giocare un ruolo chiave nell’ ambito di malattie neurodegenerative come la SLA. Questa tesi si pone quindi l’obiettivo di studiare il profilo di espressione dei miRNA nella SLA e di confrontarlo con quello di soggetti sani, in modo da portare alla luce eventuali disregolazioni di specifici miRNA e dunque delineare un pattern di espressione caratteristico della SLA. Per fare questo abbiamo prelevato fibroblasti cutanei da pazienti SLA e da soggetti sani, e li abbiamo riprogrammati in cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC). Quindi abbiamo differenziato le iPSC in MN maturi e abbiamo analizzato il profilo di espressione dei miRNA sia nelle iPSC che nei MN tramite analisi di next generation sequencing (NGS). Dato chi i miRNA non sono presenti solo all’ interno delle cellule, ma si ritrovano anche in molti fluidi corporei assemblati in microvescicole chiamate esosomi, abbiamo voluto isolare gli esosomi derivati dalle IPSC e dai MN, andando quindi ad analizzare il profilo di espressione dei miRNA all’ interno di tali vescicole. L’identificazione della disregolazione di specifici miRNA nella SLA potrebbe aiutare nel comprendere la patogenesi della SLA, introdurre nuovi marker diagnostici e aprire le porte a nuove frontiere terapeutiche per questa malattia attualmente incurabile. 

Secondo premioapprocci terapeutici sperimentali nella malattia di Duchenne (dott.ssa Maria Santaniello, Università di Genova)
Introduzione e Scopo dello Studio: Questa tesi intende affrontare l’argomento del trattamento della distrofia muscolare di Duchenne, malattia “rara”, ovvero patologia con prevalenza inferiore a 5 casi su 10.000 nati vivi. I farmaci dedicati a malattie rare sono detti “orfani” e possono avvalersi di speciali indicazioni legislative per divenire remunerativi per le industrie farmaceutiche. La DMD è una malattia ereditaria a trasmissione recessiva legata al cromosoma X causata da una mutazione del gene che codifica per la distrofina; la mancanza o l’azione incompleta della proteina indebolisce il sarcolemma e provoca una cascata di eventi che portano alla necrosi muscolare. La perdita di forza muscolare è progressiva: la maggior parte dei bambini diventa incapace di camminare tra i 10 e i 12 anni e la morte interviene per complicanze polmonari e cardiache verso la fine della seconda decade. Scopo di questo studio è stato individuare le strategie terapeutiche al momento disponibili e/o di prossima possibile commercializzazione, soffermandoci sulla strategia portata avanti dal Reparto di Neurologia pediatrica e Malattie muscolari del Gaslini di Genova. 
Materiali e metodi: Abbiamo suddiviso le varie strategie terapeutiche in: farmaci già in commercio o di prossima introduzione, cioè a) corticosteroidi, fino a poco tempo fa l’unica terapia disponibile; b)  ataluren, primo farmaco orale specificamente mirato alla patologia, per il ristretto gruppo di pazienti con mutazione non senso, deambulanti. La sua azione consiste nel superare il codone di stop prematuro con sintesi di una proteina funzionante; c) eteplirsen, approvato dalla FDA per i portatori di una delezione genica trattabile con lo skipping dell’esone 51. I farmaci in studio e sperimentazione clinica avanzata sono rappresentati da molecole come la più naturale epicatechina o rimeporide, mentre infine fra i farmaci in sperimentazione precoce si può citare gavinostat; a questa classe appartiene anche la strategia dell’inibizione del proteasoma, complesso proteolitico che entra in gioco nel danno muscolare in corso di DMD, che è stata pensata come possibile alternativa terapeutica dal gruppo del prof. Minetti. Con l’inibitore del proteasoma già in commercio sono stati effettuati inizialmente studi sull’animale per poi verificare l’effetto dell’incubazione di frammenti muscolari derivati da biopsie del quadricipite femorale di 8 pazienti DMD e 8 con la variante di Becker (DMB) della malattia. I frammenti sono stati esposti a concentrazioni di 1 e 10µM di bortezomib per 16 ore. Al termine dell’esposizione, sono stati analizzati con osservazioni di immunoistochimica e western blot (WB) per la distrofina, il β-destroglicano e l’α-sarcoglicano.
Risultati: Nei campioni DMB il trattamento con l’inibitore del proteasoma ha aumentato significativamente l’espressione in membrana di DYS,α-SG e β-DG in tutti i pazienti, in quelli DMD ha incrementato l’espressione di α-SG e β-DG in 6/8 pazienti e di DYS in 6/8 pazienti all’immunoistochimica, ma l’esame WB non ha purtroppo confermato l’incremento. I due pazienti che non hanno risposto al trattamento mostravano un severo danno muscolare con un’alta sostituzione delle fibre muscolari con tessuto fibrotico-grasso.
Conclusioni: Questa tesi ha affrontato un particolare problema relativo all’introduzione sul mercato di farmaci destinati a patologie “rare”, ovvero condizioni potenzialmente mortali o cronicamente debilitanti che colpiscono non più di 5/10.000 soggetti. Negli ultimi anni il Parlamento europeo ha adottato uno specifico regolamento che ha incentivato le industrie del farmaco alla ricerca su queste patologie; ciò è in parte responsabile di questa interessante fioritura di trattamenti.

Terzo premioNuove prospettive nella DMD: il ruolo della distrofina nella netosi (dott.ssa Lisa Lerjefors, Università di Padova)
Presupposti dello studio. La distrofia muscolare di Duchenne (DMD) è una malattia neuromuscolare legata al cromosoma X, causata da mutazioni del gene DMD, codificante per la proteina distrofina. La distrofina, è una proteina espressa in numerosi tessuti, ma la sua assenza comporta problemi soprattutto dal punto di vista muscolare. I bambini affetti da DMD nascono apparentemente sani, ma intorno ai 3-4 anni solitamente si rende evidente il deficit di forza caratterizzato da cadute frequenti, difficoltà nella corsa e nell’alzarsi da terra.  Il deficit di forza è progressivo e compromette la funzionalità motoria del bambino, interessando prima la muscolatura prossimale e poi quella distale, senza risparmiare muscolo cardiaco e diaframma. La deambulazione autonoma viene persa intorno ai 10-15 anni, e l’aspettativa di vita è ridotta per complicanze respiratorie e cardiache. Attualmente l’unica terapia farmacologica largamente utilizzata per rallentare la malattia sono i glucocorticoidi. Una terapia risolutiva è ancora mancante nonostante siano in atto molti studi clinici. La distrofia muscolare di Becker (BMD) è una forma allelica clinicamente più mite, causata da mutazioni che permettono l’espressione parziale di distrofina.Nel tessuto muscolare distrofico ha luogo una risposta infiammatoria secondaria che coinvolge diverse cellule del sistema immunitario, principalmente macrofagi e linfociti. I neutrofili sembrano coinvolti soprattutto nelle fasi iniziali del processo distrofico. Un’arma che i neutrofili possono utilizzare nell’infiammazione è la NETosi, termine derivato dall’acronimo Neutrophil Extracellular Traps e dall’analogia con i termini necrosi e apoptosi, che descrivono altri tipi di morte cellulare. Infatti, la NETosi è una forma di morte cellulare programmata con rilascio di reti di acidi nucleici e proteine battericide. La NETosi è stata largamente studiata nelle malattie infettive e nelle malattie autoimmuni, mentre mancano studi su un eventuale ruolo della NETosi nelle distrofie muscolari, che si può ipotizzare vista l’importanza dell’infiammazione nei processi patologici in atto nel tessuto muscolare distrofico.
Scopi dello studio. Lo scopo iniziale dello studio è stato valutare l’entità della NETosi nei neutrofili dei pazienti con distrofia muscolare di Duchenne. I risultati dei primi esperimenti ci hanno quindi portato ad un altro interrogativo, ossia se la distrofina potesse essere coinvolta nel processo della NETosi, e se la sua assenza potesse in qualche modo comprometterla. 
Materiali e metodi. La valutazione della NETosi è stata eseguita su neutrofili isolati da sangue di pazienti affetti da distrofia muscolare di Duchenne (DMD) e distrofia muscolare di Becker (BMD) e di soggetti sani (controlli), e stimolati con PMA e ionomicina, due sostanze che inducono due tipi diversi di NETosi. Per misurare la NETosi è stato quantificato il rilascio di DNA dai neutrofili con l’utilizzo di fluorofori diretti contro gli acidi nucleici; in più, per confermare che si trattasse veramente di NETosi, è stata eseguita la ripresa live al microscopio dei neutrofili soggetti a netosi. Per verificare se la distrofina fosse espressa dai neutrofili ed individuare quali isoforme fossero espresse, sono stati eseguiti esperimenti di RT-PCR e sequenziamento del cDNA e immunofluorescenza con anticorpi anti-distrofina su neutrofili di un donatore sano.
Risultati.L’entità della NETosi è risultata marcatamente e significativamente più bassa nei neutrofili dei soggetti affetti da DMD e BMD rispetto a quelli dei soggetti sani, sia nel caso delle cellule stimolate con PMA sia di quelle stimolate con ionomicina. La RT-PCR e il sequenziamento dell’amplificato non hanno dimostrato la presenza di distrofina full-length nei neutrofili, mentre sembra che sia presente l’isoforma a basso peso molecolare Dp71, costituita dal dominio C-terminale. Con immunoistochimica, la distrofina e l’-, - e -sarcoglicano appaiono essere presenti a bassissimo livello ed in maniera discontinua alla periferia dei neutrofili e ad elevata concentrazione nel citoplasma di alcuni neutrofili, con livelli variabili.
Discussione.I risultati dei nostri esperimenti suggeriscono che l’assenza o la riduzione di distrofina comportino una importante riduzione della capacità di eseguire la NETosi da parte dei neutrofili. Non è chiaro quale sia il collegamento tra le mutazioni genetiche dei nostri pazienti e la riduzione della NETosi, infatti tali mutazioni portano ad un difetto di produzione della isoforma full-length della distrofina, che non sembra essere presente nei neutrofili. Per giungere ad una piena comprensione dei meccanismi che sottendono questi risultati, sono necessari ulteriori studi. Tuttavia, i nostri dati espandono lo spettro del coinvolgimento multisistemico delle distrofinopatie, a includere anche la risposta immunitaria innata, e suggeriscono nuovi aspetti riguardo i meccanismi molecolari della NETosi.

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